Elektroforeza to technika biologii molekularnej, w której do rozdzielania biomolekuł na podstawie stosunku ich wielkości do ładunku elektrycznego stosuje się kontrolowany prąd elektryczny, przy użyciu galaretowatej matrycy (żelu) jako podstawy.

Jednym z powszechnych zastosowań tej techniki jest realizacja tzw. elektroforezy DNA, którą można przeprowadzić w żelach agarozowych lub poliakryloamidowych. Oba mają różne właściwości pod względem właściwości i sposobu przygotowania, więc jeden lub drugi będzie używany w zależności od zastosowania i celów, do których należy dążyć. Elektroforeza w żelu agarozowym jest standardową metodą rozdzielania i oczyszczania fragmentów DNA, gdy nie jest wymagana wysoka zdolność rozdzielcza. Z kolei elektroforeza w żelach poliakryloamidowych, choć ma większe ograniczenia pod względem wielkości fragmentów, które możemy rozdzielić (5-600 pz), ma znacznie wyższą zdolność rozdzielczą, pozwalającą na rozdzielenie cząsteczek różniących się tylko para zasad. Żele poliakryloamidowe działają pionowo i mają tę wadę, że są bardziej skomplikowane w wytwarzaniu i obsłudze.

W tym artykule skupimy się na krokach przeprowadzania elektroforezy DNA na żelach agarozowych:

Przygotowanie żelu agarozowego

• Odważyć ilość agarozy niezbędną do uzyskania pożądanego stężenia w oparciu o objętość żelu.
• Dodaj agarozę do buforu (TAE 1x lub TBE 0.5x) w kolbie.
• Ogrzewać mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż cała agaroza się roztopi.
• Pozostaw roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury około 50°C.
• Podczas stygnięcia roztworu agarozy przygotuj formę, w której będzie wykonany żel, zaklejając krawędzie taśmą maskującą lub umieszczając ją w przewidzianym do tego urządzeniu i ustawiając grzebień w żądanej pozycji.
• Ostrożnie wlej roztwór agarozy do płaskiej formy i pozostaw do zestalenia na co najmniej 30 min.

przygotowanie próbki

• Zmieszaj obie próbki DNA i marker wielkości z 0.2 objętościami 6x buforu obciążającego. Całkowita objętość będzie określona przez wielkość dołków, zwykle 15-30 µl.

Ładowanie próbek i uruchamianie żelu

• Po zastygnięciu żelu zdjąć uszczelkę z krawędzi i umieścić formę z żelem w komorze do elektroforezy.
• Dodać bufor do elektroforezy (TAE 1x lub TBE 0.5x), aż żel pokryje około 3-5 mm.
• Ostrożnie zdejmij grzebień, aby uwolnić studzienki z próbkami.
• Załaduj do studzienek próbki przygotowane w kroku 7.
• Podłącz przewody do zasilania i przyłóż napięcie 20-150 V (1-5 V/cm w zależności od odległości między elektrodami). Ustawienie napięcia jest bardzo zmienne w zależności od komory i rozmiarów, które mają być rozdzielone, przy bardzo dużych rozmiarach DNA zalecane są niezbyt wysokie napięcia.
• Rozprowadź żel, aż błękit bromofenolowy znajdzie się w odległości około 25% całkowitej długości żelu od krawędzi. W tym czasie należy przerwać elektroforezę.

Barwienie żelu i wizualizacja DNA

• Jeśli do żelu nie dodano bromku etydyny, żel należy wybarwić po zakończeniu elektroforezy. W tym celu żel wyjmuje się z formy i zanurza w roztworze bromku etydyny (0.5 µg/ml) na co najmniej 15 minut.
• Umieść żel na transiluminatorze i włącz lampę światła ultrafioletowego (λ ≈ 300 nm), DNA będzie wizualizowane jako pomarańczowe paski.
• Sfotografuj żel za pomocą dostępnego systemu fotograficznego.

At Kalsteina jesteśmy PRODUCENTAMI, więc możesz KUPIĆ doskonałe systemy do elektroforezy do swojego laboratorium w NAJLEPSZYCH CENACH. Dlatego zapraszamy do zapoznania się z naszym sprzętem dostępnym na stronie TUTAJ